臍帶除了提取造血干細(xì)胞用于細(xì)胞治療外，華通氏膠等基質(zhì)部分還能提取間充質(zhì)干細(xì)胞，因其MSC的密度較高，為組織修復(fù)等需要間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床治療帶來便利。

一 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)文獻(xiàn)

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的貼壁培養(yǎng)方法主要區(qū)別是培養(yǎng)基的選擇。

搜索方法

使用題名“臍帶+間充質(zhì)干細(xì)胞+培養(yǎng)”，摘要“無血清”在中國知網(wǎng)搜索。

使用(Umbilical Cord[Title] AND Mesenchymal Stem Cells[Title]) AND serum free[Title/Abstract] 在Pubmed搜索。

文獻(xiàn)及要點(diǎn)（按發(fā)表時(shí)間） 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)

1 無血清培養(yǎng)體系相較于人血小板裂解液培養(yǎng)體系能一定程度上提高間充質(zhì)干細(xì)胞的體外增殖能力。

2 無動(dòng)物源成份無血清培養(yǎng)基（自制）可支持臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的體外擴(kuò)增,維持其免疫學(xué)表型及分化潛能,提供數(shù)量充足的高質(zhì)量間充質(zhì)干細(xì)胞,滿足臨床治療及生物醫(yī)學(xué)研究的需要。

3 無血清與含胎牛血清培養(yǎng)基所培養(yǎng)的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在細(xì)胞形態(tài)、增殖活性、表面標(biāo)記和分化潛能相似;但在無血清培養(yǎng)基成分中無動(dòng)物源蛋白引入,是更理想的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基種類。

4 利用無血清培養(yǎng)體系獲得的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療代償性乙型肝炎肝硬化是安全的,部分患者有效,但其長(zhǎng)期的安全性和有效性有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

5 無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)的人臍帶細(xì)胞均為MSC（間充質(zhì)干細(xì)胞）,有傳代增殖潛能,傳代可達(dá)臨床治療MSC細(xì)胞量,并可避免異種蛋白致敏。

6 利用酶消化法和無血清的培養(yǎng)體系能夠快速分離培養(yǎng)出大量hUCMSCs（人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞）,該方法擴(kuò)增得到的間充質(zhì)細(xì)胞具備穩(wěn)定的細(xì)胞標(biāo)記物和生長(zhǎng)狀態(tài),可用于各種治療的臨床試驗(yàn)。

7 無血清培養(yǎng)體系可以保持間充質(zhì)干細(xì)胞（來源：臍帶華通氏膠）的特性,為替代含血清培養(yǎng)體系進(jìn)行臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞原代培養(yǎng)提供了可能。

8 臍帶不同組織來源的MSC的生物學(xué)特性及免疫調(diào)控作用與骨髓來源的MSC無明顯差異,但在支持造血的功能有所不同,隨著對(duì)MSC研究的不斷深入,其應(yīng)用的范圍將更為廣泛。

9 利用無血清的人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)體系,臍帶組織培養(yǎng)法能夠分離培養(yǎng)出大量的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞,避免了培養(yǎng)中異種蛋白的混入而降低臨床排異反應(yīng)。

英文版（按發(fā)表時(shí)間）

10 無血清培養(yǎng)基中，胰島素促進(jìn)臍帶基質(zhì)間充質(zhì)干細(xì)胞的擴(kuò)增和生長(zhǎng)。

11 臍帶華通氏膠間充質(zhì)干細(xì)胞3D分化無血清培養(yǎng)條件：生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和小分子。

12 使用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)原代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。

13 使用MesenCult-XF 培養(yǎng)基培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。

14 MesenCult-XF無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞25代的情況。

15 使用無動(dòng)物源、無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，不影響MSC的表型和分化潛能。

結(jié)論

采用無血清培養(yǎng)基可以進(jìn)行人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的原代及傳代培養(yǎng)，同時(shí)保有MSC的表型和分化潛力。

二 商用人間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基

 人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基的發(fā)展

 *代 培養(yǎng)基+牛血清

 第二代 培養(yǎng)基+牛血清替代品：人血清、血小板裂解液   和臍帶血清

 第三代 無血清、無動(dòng)物源、成分確定的培養(yǎng)基

第三代人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基不含牛血清或人血清之類的血清替代品，無動(dòng)物源而且成分確定，免除了異種血清帶來的病原體污染風(fēng)險(xiǎn)，而且批次穩(wěn)定，適合干細(xì)胞治療的臨床研究。

品牌      貨號(hào)         產(chǎn)品描述

HY StemCell  HX0201M       CCGmHuMTM  Human MSCs Medium 人間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，成分確定、無動(dòng)物源

StemCell    05420       MesenCultTM-XF Medium，Defined, xeno-free medium for human mesenchymal stem cells 人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基，成分確定、無動(dòng)物源

StemRD     MGro-500     MSC medium,chemically-defined, xeno-free人間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，成分確定、無動(dòng)物源

LONZA      12-725F    UltraCULTURETM Serum-free Medium無血清培養(yǎng)基

文獻(xiàn)目錄及中文摘要

[1]孫亞如,張炳強(qiáng),王福斌,許評(píng),王二樸,李翠翠.培養(yǎng)體系對(duì)維持人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞特性及其體外擴(kuò)增效率的影響[J].中國組織工程研究,2017,21(13):2023-2028.

摘要：背景:前期數(shù)據(jù)顯示,應(yīng)用人血小板裂解液培養(yǎng)體系對(duì)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)時(shí),較無血清培養(yǎng)體系能更好地維持干細(xì)胞特性,而無血清培養(yǎng)體系相較于人血小板裂解液培養(yǎng)體系能一定程度上提高間充質(zhì)干細(xì)胞的體外增殖能力。目的:篩選能zui大限度維持人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞特性及擴(kuò)增效率高的培養(yǎng)體系。方法:將6份人臍帶標(biāo)本分別接種于6種培養(yǎng)體系中,進(jìn)行臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞原代培養(yǎng),6種培養(yǎng)體系分別為MesenC ult無血清*培養(yǎng)基中添加2%人血小板裂解液(A組)、StemPro無血清*培養(yǎng)基中添加2%人血小板裂解液(B組)、MesenC ult無血清*培養(yǎng)基(C組)、Stem Pro無血清*培養(yǎng)基(D組)、低糖DMEM中添加體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清(E組)、低糖DMEM中添加10%人血小板裂解液(F組),14 d后進(jìn)行消化傳代培養(yǎng),比較各培養(yǎng)體系對(duì)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)、表面標(biāo)記物、分化及增殖能力的影響。結(jié)果與結(jié)論:(1)D組第3代細(xì)胞細(xì)長(zhǎng),大小不均;E、F組第3代細(xì)胞扁平,其余組第3代細(xì)胞為長(zhǎng)梭形且大小較均一。A、B組第5代細(xì)胞形態(tài)及大小較第3代時(shí)無明顯變化,C組第5代細(xì)胞趨于扁平且大小不均一,D組第5代細(xì)胞形態(tài)較第3代時(shí)細(xì)長(zhǎng),E組第5代細(xì)胞形態(tài)較第3代時(shí)扁平,F組第5代細(xì)胞形態(tài)較第3代時(shí)無明顯變化;(2)各組細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果無明顯區(qū)別;(3)A、B組成脂、成骨誘導(dǎo)率較高,E、F組次之,C、D組zui低;(4)A組各代次細(xì)胞擴(kuò)增數(shù)量顯著高于C組,B組各代次細(xì)胞擴(kuò)增數(shù)量顯著高于D組,E、F組擴(kuò)增數(shù)量顯著低于培養(yǎng)組A、B組;(5)結(jié)果表明,無血清和人血小板裂解液相結(jié)合的培養(yǎng)基能較好地維持間充質(zhì)干細(xì)胞的特性及擴(kuò)增效率

[2]任春紅,張昕.無動(dòng)物源成分培養(yǎng)基用于人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)的研究[J].延安大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)科學(xué)版),2015,13(01):1-4.

摘要：目的建立一種無動(dòng)物源成份無血清的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基XF/SF-MSCM,并探討其支持人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(h UC-MSCs)體外增殖、維持分化潛能的效果。方法組織塊貼壁法分離獲得原代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞,P1代起分別使用自制的XF/SF-MSCM培養(yǎng)基與含10%胎牛血清的傳統(tǒng)培養(yǎng)基(SC-MSCM)對(duì)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)傳代至P6代,觀察比較兩組P6代細(xì)胞的形態(tài)及增殖能力,以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)連續(xù)傳代后細(xì)胞的免疫學(xué)表型,比較其成骨、成脂肪的分化潛能。結(jié)果分離獲得的原代P0臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞,分別在XF/SFMSCM與SC-MSCM兩種培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)傳代,細(xì)胞增殖能力及形態(tài)無顯著差別。兩組P6代細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線相似,但XF/SF-MSCM組間充質(zhì)干細(xì)胞貼壁的緊密程度稍低;流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示,XF/SF-MSCM組細(xì)胞保持了間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫學(xué)表型,高表達(dá)CD29、CD44、CD90,不表達(dá)CD31、CD34、CD45并維持了良好的成骨和脂肪細(xì)胞的分化能力。結(jié)論本室制備的無動(dòng)物源成份無血清培養(yǎng)基XF/SF-MSCM可支持臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的體外擴(kuò)增,維持其免疫學(xué)表型及分化潛能,提供數(shù)量充足的高質(zhì)量間充質(zhì)干細(xì)胞,滿足臨床治療及生物醫(yī)學(xué)研究的需要。

[3]陳林,張坤,董偉,楊珂,艾輝,陳祿華.臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無血清和含胎牛血清培養(yǎng)體系比較[J].重慶理工大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)),2014,28(09):57-61+86.

摘要：為了比較在無血清與含胎牛血清培養(yǎng)基中人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖能力、生物學(xué)特性、分化潛能,將臍帶華通氏膠剝出剪碎,分別在無血清與含胎牛血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)擴(kuò)增臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性,并繪制生長(zhǎng)曲線;在倒置顯微鏡下對(duì)細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察;利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)鑒定其表面標(biāo)記CD73,CD90,CD105,CD14,CD34,CD45,CD79a及HLA-DR的表達(dá);將成骨及成脂誘導(dǎo)液培養(yǎng)1~2周后觀察其細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,用堿性磷酸酶染色鑒定其成骨情況,油紅O染色鑒定其成脂情況。結(jié)果表明:無血清與含胎牛血清培養(yǎng)基所培養(yǎng)的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在細(xì)胞形態(tài)、增殖活性、表面標(biāo)記和分化潛能相似;但在無血清培養(yǎng)基成分中無動(dòng)物源蛋白引入,是更理想的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基種類。

[4]鄧福珠,畢曉云,何蓉,黃舒,陳晶礪,陳嘉榆,王恒湘,郭子寬.無血清培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療乙型肝炎肝硬化的臨床觀察[J].組織工程與重建外科雜志,2014,10(03):141-144+167.

[5]周平,李丹,陳廣華,王易.無血清培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的研究[J].中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志,2013,21(05):1256-1260.

摘要：本研究觀察無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(UC-MSC),并比較與含10%胎牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng)的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的異同。采集正常足月剖宮產(chǎn)胎兒臍帶,用MesenCult-XF無血清培養(yǎng)液或含10%胎牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng)。觀察不同培養(yǎng)液培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞的形態(tài)、免疫表型、細(xì)胞周期、增殖分化潛能及對(duì)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)的抑制作用。結(jié)果表明,采用無血清MesenCult-XF培養(yǎng)液培養(yǎng)的MSC平均傳代倍增6.57±0.7倍,含血清培養(yǎng)液培養(yǎng)的MSC平均傳代倍增4,59±0.45倍(P<0.05);兩種培養(yǎng)液培養(yǎng)的MSC均表達(dá)CD44、CD90、CD73、CD105抗原,不表達(dá)CD31、CD45、HLA-DR及CD34等抗原,表達(dá)程度無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)的MSC(65±5.2)%均為G o/G1期細(xì)胞,含血清培養(yǎng)液培養(yǎng)的MSC(62±3.1)%為G o/G1期細(xì)胞(P>0.05);兩種培養(yǎng)液培養(yǎng)的人臍帶MSC均可向成脂細(xì)胞、成骨細(xì)胞分化;無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)的臍帶MSC按1 000、5 000、10 000、20 000個(gè)細(xì)胞/孔接種密度與反應(yīng)細(xì)胞和刺激細(xì)胞共培養(yǎng)的每分鐘閃爍值(CPM)分別為(6.43±0.47)×104、(4.30±0.38)×104、(1.97±0.13)×104和(0.24±0.03)×104,含血清培養(yǎng)液培養(yǎng)的MSC與不同密度的混合淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)的CPM值分別為(7.85±0.07)×104、(5.64±0.12)×104、(3.09±0.18)×104和(1.73±0.05)×104。結(jié)論:無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)的細(xì)胞均為MSC,有傳代增殖潛能,傳代可達(dá)臨床治療MSC細(xì)胞量,并可避免異種蛋白致敏。

[6]李蘭蘭,馬炬明,陳玲肖.臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生,2013,51(27):85-87.

摘要：目的建立一種簡(jiǎn)單的體外無血清培養(yǎng)擴(kuò)增人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)的方法。方法利用酶消化法分離hUCMSCs,在無血清干細(xì)胞培養(yǎng)體系下培養(yǎng)擴(kuò)增,進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察,CCK-8法分析細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞表面抗原表達(dá)及細(xì)胞周期,進(jìn)行成骨、成脂誘導(dǎo)分化。結(jié)果 hUCMSCs呈典型的成纖維細(xì)胞形態(tài),具有較強(qiáng)的增殖能力。CD29、CD44、CD90、CD105均呈陽性表達(dá),而CD34、CD45呈陰性表達(dá)。3周可誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞。結(jié)論利用酶消化法和無血清的培養(yǎng)體系能夠快速分離培養(yǎng)出大量hUCMSCs,該方法擴(kuò)增得到的間充質(zhì)細(xì)胞具備穩(wěn)定的細(xì)胞標(biāo)記物和生長(zhǎng)狀態(tài),可用于各種治療的臨床試驗(yàn)。

[7]周婷婷,衛(wèi)超,陳曉東,李海,汪錚.無血清培養(yǎng)體系原代培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞[J].中國組織工程研究,2013,17(27):4980-4987.

摘要：背景: 以含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞,存在著進(jìn)一步應(yīng)用的障礙。目的: 建立無血清培養(yǎng)體系原代培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。方法: 取臍帶華通氏膠(Wharton’sJelly),采用機(jī)械法將組織膠切碎,1-3mm3大小,分別培養(yǎng)到含胎牛血清*培養(yǎng)液中以及無血清培養(yǎng)液中。培養(yǎng)第11,14,17天收獲細(xì)胞并進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。在符合2006年制定的干細(xì)胞zui低評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上,以集落形成單元指標(biāo)評(píng)估何種培養(yǎng)體系能獲得較多高質(zhì)量的原代細(xì)胞。結(jié)果與結(jié)論: 無血清培養(yǎng)體系相對(duì)于經(jīng)典的含血清的培養(yǎng)體系而言,細(xì)胞生長(zhǎng)速度更快。另外,培養(yǎng)第11天,集落形成實(shí)驗(yàn)表明無血清培養(yǎng)體系下能獲得更多的集落。因此,無血清培養(yǎng)體系可以保持間充質(zhì)干細(xì)胞的特性,為替代含血清培養(yǎng)體系進(jìn)行臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞原代培養(yǎng)提供了可能。

[8]徐曼. 人臍帶不同組織來源間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及其免疫調(diào)控能力和支持造血的實(shí)驗(yàn)研究[D].2011.

摘要：間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell,MSC)是來源于發(fā)育早期中胚層的具有高度自我更新和多向分化潛能的多能干細(xì)胞,廣泛存在于全身多種組織中。大量研究證明,MSC具有低免疫原性、多向分化潛能、調(diào)節(jié)免疫以及分離培養(yǎng)操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)。MSC的臨床研究已經(jīng)在許多國家開展,作為種子細(xì)胞,臨床上主要用于治療機(jī)體無法自然修復(fù)的組織細(xì)胞和器官損傷等多種難治性疾病,如脊髓損傷、腦癱、肌萎縮側(cè)索硬化癥、中風(fēng)、糖尿病、糖尿病足、肝硬化等;作為免疫調(diào)節(jié)和造血支持細(xì)胞,用于治療免疫排斥和自身免疫性疾病,如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、系統(tǒng)性硬化癥、克隆氏病等。MSCzui早在骨髓中發(fā)現(xiàn),但骨髓中含量極少,且骨髓源性MSC存在高度病毒污染的可能,并且隨著年齡的增長(zhǎng)其細(xì)胞數(shù)量和擴(kuò)增分化能力亦顯著降低。近年來,國內(nèi)外大量研究證明臍帶作為胎兒發(fā)育的一部分,含有大量的多能干細(xì)胞,細(xì)胞生長(zhǎng)擴(kuò)增速度快,且臍帶屬于胚胎外組織,在胎兒娩出后成為“廢棄物”,取材方便,來源豐富,無倫理學(xué)問題,因此,被看作是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的主要替代品,具有巨大的臨床應(yīng)用價(jià)值。不同學(xué)者分別從整條臍帶、臍帶的基質(zhì)、臍靜脈內(nèi)皮中分離獲得MSC,還有為數(shù)不少的學(xué)者從胎盤羊膜中分離獲得MSC?？紤]到臍帶組織構(gòu)成簡(jiǎn)單,包括表皮(羊膜上皮細(xì)胞)、基質(zhì)(Wharton’s jelly)及血管,既無毛細(xì)血管也無淋巴管,但其超微結(jié)構(gòu)、免疫組化和活體功能研究顯示,羊膜下、血管間和血管周圍區(qū)域在細(xì)胞數(shù)量和特性上均有顯著差異,為此,我們擬將這三種組織分開,從中分別分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增MSC,并研究其生物學(xué)特性、免疫調(diào)控能力及造血支持作用,為臨床應(yīng)用提供重要依據(jù)。首先,我們通過機(jī)械分離及膠原酶消化法分別從人臍帶的羊膜(Amnion)、基質(zhì)(Wharton’s jelly)及血管(Vessel)中獲得組織細(xì)胞,通過反復(fù)貼壁純化獲得AM-MSC、WJ-MSC、VS-MSC;從整條臍帶(Umbilical cord)中獲得UC-MSC;通過密度梯度離心法從骨髓(Bone marrow)中分離得到單個(gè)核細(xì)胞,同樣通過反復(fù)貼壁純化獲得BM-MSC。然后,從細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞周期、多向分化潛能特性及細(xì)胞免疫表型五個(gè)方面進(jìn)行比較和鑒定。結(jié)果表明,五組MSC具有相似的生物學(xué)特征:1)細(xì)胞培養(yǎng)至第3代細(xì)胞形態(tài)相對(duì)均一,為典型的成纖維樣,呈平行或漩渦狀排列;2)細(xì)胞具有強(qiáng)大的體外擴(kuò)增能力;3)均有80%以上的細(xì)胞處于G0/G1,提示臍帶不同來源的MSC同BM-MSC一樣均具有典型的干細(xì)胞增殖特點(diǎn),即只有少數(shù)細(xì)胞處于活躍的增殖期;但BM-MSC的培養(yǎng)需添加低濃度的細(xì)胞生長(zhǎng)因子bFGF,且培養(yǎng)至5代后擴(kuò)增能力逐漸減低,而臍帶來源的MSC僅在低營養(yǎng)條件下即能大量擴(kuò)增,傳代至第14代,細(xì)胞生物學(xué)特性無明顯改變;4)對(duì)其誘導(dǎo)多向分化,結(jié)果表明,細(xì)胞可向成骨、成脂肪和成軟骨方向分化,但與BM-MSC相比臍帶來源的MSC成骨能力略低,臍帶來源的MSC各組間無差異;5)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞免疫表型,結(jié)果表明,臍帶不同組織來源的MSC同BM-MSC類似,均表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞特異性抗原CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD106、CD166、HLA-ABC及多能干細(xì)胞標(biāo)志物TRA-1-60,低表達(dá)或不表達(dá)造血及內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志即CD14、CD31、CD34、CD45,以及移植免疫排斥相關(guān)的表面標(biāo)志HLA-DR、CD80、CD86、CD40、CD40L;各組細(xì)胞表型進(jìn)行比較,CD166表達(dá)有顯著差異,CD31、CD106、HLA-DR的表達(dá)具有高度的顯著差異。其次,通過淋巴母細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)及混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)檢測(cè)其免疫調(diào)控能力。結(jié)果表明,對(duì)于有絲分裂原及異體抗原誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞的增殖各組MSC均有抑制作用,且這種抑制作用具有劑量依賴性,隨MSC的細(xì)胞數(shù)量逐漸增加,其抑制效應(yīng)逐漸增強(qiáng);實(shí)時(shí)定量PCR和RT-PCR方法檢測(cè)與免疫相關(guān)的細(xì)胞因子IL-10、IL-11和TGF-β1的表達(dá)亦無顯著差別,但UC-MSC組分泌的IL-6與WJ-MSC、VS-MSC、AM-MSC、BM-MSC組相比差異極其顯著(P=0.0000),WJ-MSC與AM-MSC相比也有明顯差別(p=0.008)。zui后,探討臍帶不同組織來源的MSC的造血支持作用。以臍帶不同組織來源的MSC為飼養(yǎng)層,與臍帶血造血干/祖細(xì)胞在無血清培養(yǎng)體系下共培養(yǎng)7天,檢測(cè)有核細(xì)胞、CD34+細(xì)胞和造血集落的擴(kuò)增效率。結(jié)果顯示,MSC可以在體外有效支持造血干/祖細(xì)胞的擴(kuò)增,與對(duì)照組相比差異高度顯著;且UC-MSC組的有核細(xì)胞、CD34+細(xì)胞及CFU-C的擴(kuò)增效率均顯著高于WJ-MSC、VS-MSC和AM-MSC組,多能干細(xì)胞集落CFU-Mix的擴(kuò)增效率未見顯著差異;后三者之間進(jìn)行比較,WJ-MSC組和VS-MSC組對(duì)紅系祖細(xì)胞及粒、單核系祖細(xì)胞的擴(kuò)增效率高于AM-MSC組,且經(jīng)實(shí)時(shí)定量PCR和RT-PCR方法檢測(cè)MSC分泌的造血生長(zhǎng)因子的mRNA相對(duì)表達(dá)量,其差異也支持了這一結(jié)論,其中IL-3、IL-11、HGF、TPO、EPO、VEGF、M-CSF和G-CSF的表達(dá)水平無顯著差異,而UC-MSC組IL-6、SCF、FLT3、LIF的表達(dá)量顯著高于其它各組。上述結(jié)果提示,臍帶不同組織來源的MSC的生物學(xué)特性及免疫調(diào)控作用與骨髓來源的MSC無明顯差異,但在支持造血的功能有所不同,隨著對(duì)MSC研究的不斷深入,其應(yīng)用的范圍將更為廣泛。而作為種子細(xì)胞,不同組織來源的MSC的功能亦有不同,值得我們進(jìn)一步深入探討和研究。

[9]方彥艷,馬健.無血清培養(yǎng)基分離培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的研究[J].同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2010,31(05):21-24.

摘要：目的探討應(yīng)用無血清培養(yǎng)體系分離培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞,明確其成骨生物學(xué)特性,為臨床應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法在無血清干細(xì)胞培養(yǎng)體系下,利用組織塊貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng),擴(kuò)增臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞,在倒置顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察,流式細(xì)胞檢測(cè)鑒定其表面標(biāo)記CD34、CD44、CD90及CD45的表達(dá),成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)2～3周后觀察其細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,茜素紅染色鑒定其成骨情況。結(jié)果臍帶組織塊接種后第1次更換培養(yǎng)液12h后,有少量梭形的細(xì)胞從臍帶組織邊緣爬出,培養(yǎng)5～6d左右成單層狀生長(zhǎng),12d左右梭形狀細(xì)胞呈現(xiàn)復(fù)層生長(zhǎng)趨勢(shì),細(xì)胞表面標(biāo)記CD44、CD90均呈陽性為間充干細(xì)胞來源,CD34、CD45均呈陰性為非造血干細(xì)胞來源;細(xì)胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)2～3周后具有良好的分化成骨能力。結(jié)論利用無血清的人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)體系,臍帶組織培養(yǎng)法能夠分離培養(yǎng)出大量的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞,避免了培養(yǎng)中異種蛋白的混入而降低臨床排異反應(yīng)。

10.Insulin Promotes the Proliferation of Human Umbilical Cord Matrix-Derived Mesenchymal Stem Cells by Activating the Akt-Cyclin D1 Axis.

Li P, Wei J, Gao X, Wei B, Lin H, Huang R, Niu Y, Lim K, Jing K, Chu J.

Stem Cells Int. 2017;2017:7371615. doi: 10.1155/2017/7371615. Epub 2017 Apr 18.

11.Defined three-dimensional culture conditions mediate efficient induction of definitive endoderm lineage from human umbilical cord Wharton's jelly mesenchymal stem cells.

Al Madhoun A, Ali H, AlKandari S, Atizado VL, Akhter N, Al-Mulla F, Atari M.

Stem Cell Res Ther. 2016 Nov 16;7(1):165.

12.Three-dimensional spheroid culture of human umbilical cord mesenchymal stem cells promotes cell yield and stemness maintenance.

Li Y, Guo G, Li L, Chen F, Bao J, Shi YJ, Bu H.

Cell Tissue Res. 2015 May;360(2):297-307. doi: 10.1007/s00441-014-2055-x. Epub 2015 Mar 8.

13.Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells do not undergo malignant transformation during long-term culturing in serum-free medium.

Chen G, Yue A, Ruan Z, Yin Y, Wang R, Ren Y, Zhu L.

PLoS One. 2014 Jun 2;9(6):e98565. doi: 10.1371/journal.pone.0098565. eCollection 2014.

14.Monitoring the biology stability of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells during long-term culture in serum-free medium.

Chen G, Yue A, Ruan Z, Yin Y, Wang R, Ren Y, Zhu L.

Cell Tissue Bank. 2014 Dec;15(4):513-21. doi: 10.1007/s10561-014-9420-6. Epub 2014 Jan 10.

15.Umbilical cord tissue-derived mesenchymal stem cells grow best under GMP-compliant culture conditions and maintain their phenotypic and functional properties.

Hartmann I, Hollweck T, Haffner S, Krebs M, Meiser B, Reichart B, Eissner G.

J Immunol Methods. 2010 Dec 15;363(1):80-9. doi: 10.1016/j.jim.2010.10.008. Epub 2010 Oct 28.