試劑盒組份

操作方法選擇

根據(jù)起始樣本選擇操作方法

其他起始樣本：血漿血清、活檢、需要高通量擴(kuò)增的樣本等參見其他對應(yīng)說明書。

操作流程

方法*程

細(xì)胞樣本——加入變性混合液——65°C孵育10min——加入終止液——加入Master混合液——30°C孵育8h，65°C 終止3min——獲得擴(kuò)增DNA

方法二流程

純化基因組DNA——加入變性混合液——15-25°C孵育3min——加入neutralization混合液——加入Master混合液——30°C孵育8h，65°C 終止3min——獲得擴(kuò)增DNA

需要自備的儀器和試劑

微離心管

水浴或其他加熱儀器

微型離心機(jī)

漩渦混合儀（Vortexer）

吸管和吸頭

冰

方法一：從單細(xì)胞擴(kuò)增基因組DNA

實(shí)驗(yàn)開始前注意事項(xiàng)

1.適用樣本：1-1000個(gè)完整細(xì)胞

這個(gè)方法適用于所有物種的單細(xì)胞樣本，如：脊椎動(dòng)物，細(xì)菌（革蘭氏陽性菌和陰性菌），植物（細(xì)胞壁已脫），分選細(xì)胞，組織培養(yǎng)細(xì)胞和細(xì)胞。

不適用樣本：福爾馬林固定樣本或其他使用交聯(lián)劑固定的樣本，如：從福爾馬林固定石蠟包埋組織中激光顯微切割得到的單細(xì)胞樣本。

2.小心試劑不要被外源DNA污染。如：使用干凈獨(dú)立吸頭吸管，在無DNA地方進(jìn)行反應(yīng)操作。

3.純化基因組DNA擴(kuò)增參見方法二。

4.聚合酶要在冰上解凍（見步驟6）。其他成分可以室溫解凍（15–25°C）。

5.配制的D2緩沖液（變性緩沖液）存放不要超過3個(gè)月。

6.陰性對照（無模板）的DNA產(chǎn)量約 40 µg。因?yàn)?/span>REPLI-g 的單細(xì)胞擴(kuò)增反應(yīng)中，引物二聚體的隨機(jī)擴(kuò)增得到高分子量的DNA產(chǎn)物。這一DNA不會(huì)影響實(shí)際樣本質(zhì)量，也不會(huì)影響下游分析造成陽性結(jié)果。

開始前準(zhǔn)備

1.DLB緩沖液加500µl試劑盒的水混勻，稍微離心溶解。

注意：重組的DLB緩沖液–20°C能放6個(gè)月。

Buffer DLB is pH-labile.

2.所有緩沖液和試劑使用前都要用漩渦混合器充分混勻。

3.水浴，heating block或熱循環(huán)儀溫度設(shè)為30°C。

如果熱循環(huán)儀帶加熱蓋，蓋子溫度設(shè)為70°C。

步驟￠

1.按表1配制足量（整個(gè)擴(kuò)增流程所需）D2緩沖液（變性緩沖液）。

注意：表中提供的D2緩沖液用量足夠進(jìn)行12次反應(yīng)。沒用完的D2緩沖液–20°C 存放，但不要存放超過3個(gè)月。

表1.D2緩沖液配制

2. 4 µl樣本細(xì)胞（含PBS）加入微離心管。如果細(xì)胞不夠4 µl，加PBS sc補(bǔ)齊。

注意：REPLI-g單細(xì)胞擴(kuò)增試劑盒提供的PBS sc量不夠用于樣本細(xì)胞的連續(xù)稀釋。

可以使用0.5 µl 全血。（Alternatively, 0.5 µl whole blood can be used.）

3.加入3 µl 配制的D2緩沖液。小心輕彈試管混勻，稍微離心。

注意：確保樣本細(xì)胞沒有貼在緩沖液線上的管壁。

4.65°C孵育10min。

1. 加入3 µl 終止液。小心輕彈試管混勻，稍微離心。冰上保存。

6.冰上解凍REPLI-g sc DNA聚合酶。其他成分室溫解凍，漩渦振蕩后稍微離心。

解凍后REPLI-g sc反應(yīng)緩沖液可能會(huì)形成沉淀，漩渦振蕩10s可以溶解沉淀。

7.按表2配制master混合液?；靹?，稍微離心。

要點(diǎn)：嚴(yán)格按照表2所列順序配制。加入水和反應(yīng)緩沖液后，稍微漩渦振蕩和離心后再加入DNA聚合酶。

注意：一次性進(jìn)行多次反應(yīng)時(shí)，根據(jù)反應(yīng)數(shù)量等比例增加用量。DNA聚合酶加好后maste混合液要立即投入使用。

表2：master混合液配制

多次反應(yīng)，根據(jù)反應(yīng)數(shù)量等比例增加劑量并增加10%。

8.每次反應(yīng)，10 µl 變性DNA（步驟5）加入40 µl master 混合液。

9.30°C孵育8h。

30°C孵育后，水浴或其他加熱儀可以改設(shè)為65°C方便步驟10使用。

注意：如果使用帶加熱蓋的熱循環(huán)儀，蓋子溫度設(shè)為70°C。

10.DNA聚合酶65°C滅活3min。

11.如果不直接使用，擴(kuò)增DNA 短期儲存在4°C，長期儲存在–20°C。

使用REPLI-g 單細(xì)胞擴(kuò)增試劑盒擴(kuò)增的DNA可以當(dāng)作基因組DNA（zui低凍融循環(huán)），因此推薦zui低核酸儲存密度為100 ng/µl。

12.依照說明書用水或TE適量稀釋擴(kuò)增DNA。用于PCR分析的擴(kuò)增DNA按1:100稀釋，每次PCR反應(yīng)使用2 µl 稀釋后DNA。

13.擴(kuò)增DNA可用于一系列下游應(yīng)用，包括：第二代測序，array CGH和定量PCR。

注意：每50 µl典型反應(yīng)的DNA產(chǎn)量約40 µg，需要正確稀釋。擴(kuò)增DNA定量見附件A。

方法二：純化基因組DNA擴(kuò)增

略。詳情參見原版說明書。中文版翻譯可咨詢紅榮微再。

150343 REPLI-g Single Cell Kit單細(xì)胞擴(kuò)增試劑盒說明書節(jié)選由紅榮微再翻譯整理。

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很多研究人員使用二代測序儀器對生物樣本的DNA序列進(jìn)行分析和基因分型，但經(jīng)常受限于有限的樣本量。150343 REPLI-g Single Cell Kit單細(xì)胞擴(kuò)增試劑盒可均一的擴(kuò)增單個(gè)細(xì)胞（1至1000個(gè)細(xì)菌或腫瘤細(xì)胞）或純化的基因組DNA，能夠覆蓋基因組所有位點(diǎn)。另有于干血或新鮮或冷凍的組織樣本的實(shí)驗(yàn)方案。所有緩沖液和試劑生產(chǎn)都經(jīng)過嚴(yán)格控制的流程，避免污染DNA，確保每次實(shí)驗(yàn)獲得可靠的結(jié)果。該產(chǎn)品采用多重置換擴(kuò)增（MDA）技術(shù)，對所有基因組位點(diǎn)進(jìn)行無偏差的擴(kuò)增。與基于PCR的全基因組擴(kuò)增技術(shù)相比，該技術(shù)具有更好的擴(kuò)增高保真度，避免出現(xiàn)假陽性或假陰性信號。

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