★ 間充質干細胞無血清培養(yǎng)基細胞培養(yǎng)

　　【復蘇】

　　1.將配置好的*培養(yǎng)基放入37℃水浴中預熱5-15 min;

　　2.從液氮中取出干細胞迅速放入37℃水浴快速解凍(解凍后不要繼續(xù)孵育細胞);

　　3.在超凈臺中加入5 ml的 *培養(yǎng)基重懸細胞，1000 rpm離心5 min;

　　4.棄上清，加入 5 ml的*培養(yǎng)基重懸細胞，轉移到T-25培養(yǎng)瓶中(帶濾芯);

　　5.將培養(yǎng)瓶置于37℃，5%CO2 的無菌恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng);

　　6.第二天用新鮮的 *培養(yǎng)基給細胞換液。

　　間充質干細胞無血清培養(yǎng)基【 培養(yǎng)】

　　1.在顯微鏡下觀察細胞，當細胞融合度達到80%時，即可傳代;

　　2.37℃水浴預熱*培養(yǎng)基;

　　3.在超凈臺中，棄掉T-25細胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，加入2 ml PBS清洗，再加入1 ml 0.25%胰酶-EDTA消化細胞;

　　4.在顯微鏡下觀察到細胞變圓，有細胞開始脫離瓶壁時，即可加入5 ml *培養(yǎng)基終止消化;

　　5.用移液器輕輕吹打瓶壁上剩余的細胞，并輕輕吹打將細胞吹散;

　　6.將細胞轉移到15 ml離心管中，1000 rpm離心5 min;

　　7.棄上清,加入15-20 ml的 *培養(yǎng)基重懸細胞后轉入T-75細胞培養(yǎng)瓶中或按適當比例傳到T-25細胞培養(yǎng)瓶中。確保后融合度在25-50%之間，細胞密度在1×104cells/cm2 (2.5×105 cells/T-25瓶)，混合細胞懸液，確保細胞均勻分布;

　　8.將細胞培養(yǎng)瓶置于37℃，5%CO2 的無菌恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng);

　　9.每兩天用新鮮、預熱的*培養(yǎng)基進行換液。

　　間充質干細胞無血清培養(yǎng)基【凍存】

　　1.細胞消化和計數(shù)，用胰酶對待凍存的細胞進行消化，并對細胞進行計數(shù)。

　　2.1000 rpm離心5 min，去掉上清。

　　3.根據(jù)細胞計數(shù)的情況，加入適量的凍存液，使細胞密度在1×106/ml左右(或根據(jù)自己希望達到的細胞密度)。

　　4.輕輕地重懸細胞(務必重懸均勻)，將重懸的細胞按等份加入到滅菌的凍存管(需提前做好標記或者貼上標簽)中，旋緊凍存管蓋。

　　5.將凍存管放入程序降溫凍存盒中，然后將凍存盒直接放入-80℃。

　　6.第二天將細胞從-80℃轉移到液氮中。